หน้าที่ 1 - วิธีใหม่ที่ใช้ในการตรวจหาเชื้อไวรัส HIV
นักวิจัยจากสหราชอาณาจักรได้พัฒนาวิธีการตรวจการติดเชื้อไวรัส HIV โดยพัฒนาหลักการของ Colorimetric ELISA ในการตรวจวัด ซึ่งวิธใหม่นี้สามารพเพิ่มความแม่นยำและความว่องไวมากขึ้นกว่าวิธีเดิมที่ใช้กันอยู่ในปัจจุบัน
โรเบิร์ตโต เดอ ลา ริกา และ มอลลี่ สตีเฟน ศาสตราจารย์ด้านชีววัสดุทางการแพทย์ จากวิทยาลัยคอลเลจ สหราชอาณาจักร ได้คิดวิธีการใหม่นี้ขึ้นโดยอาศัยเทคโนโลยีตรวจจับเครื่องหมายโมเลกุลที่บ่งชี้ว่ามีการติดไวรัส HIV (HIV biomarker) คือ p24 ในตัวอย่างเลือดของผู้ป่วย
แอนติเจน p24 เป็นโปรตีนที่อยู่ในส่วนแกน (core protein) ของเชื้อ HIV ซึ่งจะมีการสังเคราะห์ขี้นในเซลล์ที่มีการติดเชื้อ HIV และปล่อยออกมาสู่กระแสเลือดในระยะเริ่มแรกของการติดเชื้อ และระยะท้าย ๆ ของการเป็นโรคเอดส์ ทำให้สามารถตรวจแอนติเจน p24 ได้ในเลือดของผู้มีการติดเชื้อ HIV ซึ่งจะมีรูปแบบของแอนติเจนในกระแสเลือดได้ 4 ลักษณะ คือ 1. แอนติเจนอิสระ (free antigen) และ แอนติเจนอยู่รวมกับแอนติบอดี (antigen-antibody complex) 2. ไม่พบแอนติเจนในรูปแบบอิสระในระยะแรก แต่จะมีแอนติเจนรวมอยู่กับแอนติบอดี 3. พบแต่แอนติเจนอิสระ แต่ไม่พบแอนติเจนอยู่รวมกับแอนติบอดี 4. ไม่พบทั้งแอนติเจนอิสระและแอนติเจนอยู่รวมกับแอนติบอดี
นอกจากรูปแบบที่แตกต่างกันทั้ง 4 อย่างนี้แล้ว ยังพบว่าระดับแอนติเจนชนิด p24 ในกระแสเลือด ยังมีการเเปลี่ยนแปลงระดับขึ้น ๆ ลง ๆ (fluctuation) ได้ในเวลาที่ต่างกัน ซึ่งทำให้เกิดความสับสนในการตรวจหา และแปรผลที่ได้
รูปร่างของไวรัส HIV
ในปัจจุบันจะเป็นการตรวจหาแอนติบอดี้ต่อเชื่อ HIV / การตรวจหาชิ้นส่วนหรือตัวเชื้อของไวรัส HIV นับตั้งแต่ได้มีการพัฒนาชุดตรวจหาแอนติบอดี้ต่อเชื้อ HIV ขึ้นในปี คศ 1985 ได้มีการผลิตชุดทดสอบหาแอนติบอดี้ออกมาหลายรูปแบบ หนึ่งในนั้นก็คือ Enzyme-linked immunosorbant assays (ELISA) และ Rapid screening HIV tests
ชุดน้ำยาที่ผลิตออกในในยุคแรก ( first generation) ตัวแอนติเจนที่ใช้ในการทดสอบนั้นยังทำจากตัวเชื้อ HIV จริง (Viral lysate) ซึ่งยังมีอันตรายต่อผู้ทำการทดสอบได้อยู่ และผลบวกที่ได้นั้นจะต้องนำไปทดสอบยืนยันด้วยวิธี Western Blot technology ซึ่งเป็นวิธีที่มีขั้นตอนการทดสอบที่ซับซ้อน ต้องใช้เวลานาน และราคาทดสอบที่ค่อนข้างสูง
ถัดมาได้มีการพัฒนาชุดทดสอบหาแอนติบอดี้ต่อเชื้อไวรัส HIV ต่อมาเป็นรุ่นที่สอง ( Second generation) และรุ่นที่สาม ( Third generation ) ตามลำดับ โดยเป็นการพัฒนาแอนติเจนที่ใช้ในการทดสอบจากการใช้จากเชื้อไวรัสจริงมาใช้หลักการ recombinant proteins and synthetic peptides นอกจากจะทำให้ผู้ทำการทดสอบมีความปลอดภัยมากขึ้นแล้ว ยังเพิ่มความไว(sensitivity) และ ความจำเพาะ (specificity) ของการทดสอบให้สูงมากขึ้นอีกด้วย ทำให้เวลาที่ใช้ในการทำการทดสอบสั้นลง (แบบ rapid test ใช้เวลาแค่ 15-20 นาที) และทำให้เวลาของ window period สั่นลงอีกด้วย (ปัจจุบัน window period ลดลงมาเหลือที่ไม่เกิน 3 เดือน บางผลิตภัณฑ์ สามารถตรวจได้ในช่วง 2 เดือนขึ้นไป แต่ตามมาตรฐานของ WHO กำหนดให้เริ่มตรวจครั้งแรกหลังจากเกิดความเสี่ยงมาแล้ว 3 เดือนขึ้นไป หากผลยังไม่ชัดเจนให้ตรวจซ้ำต่อไปที่ช่วง 6 เดือนและหรือที่ 12เดือนในบางกรณีต่อไป
"หลังจากการได้รับเชื้อเข้าสู่ร่างกายแล้ว แต่ตรวจไม่พบแอนติบอดี ระยะนี้เรียกว่า window period"
ล่าสุดได้มีการพัฒนาชุดทดสอบไปเป็นรุ่นที่ 4 ( forth generation) ซึ่งในรุ่นนี้ได้มีการพัฒนาการตรวจหาแอนติเจนและแอนติบอดี้ไปพร้อมกันในรูปแบบ rapid screening test สำหรับการตรวจหาแอนติเจนจะเน้นการตรวจหาแอนติเจน p24 ในเลือดเป็นหลัก ด้วยใช้วิธีการตรวจแบบ colorimetric ELISA ซึ่งสามารถตรวจหาตัวเชื้อในช่วงที่แอนติบอดี้ยังไม่ขึ้น หรือที่เรียกว่า window period
หลักการของวิธีการตรวจแบบ colorimetric Sandwich ELISA คือ การที่ใช้แอนติบอดี 2 ชนิด ที่จําเพาะกับแอนติเจน p24 โดยแอนติบอดี้แรกใช้เคลือบหลุม ELISA เพื่อคอยจับแอนติเจนจากตัวอย่าง ก่อนนําแอนติบอดี้ตัวที่สองเข้ามาจับกับแอนติเจน (รูปแบบการจับกันของแอนติบอดี้ - แอนติเจน - แอนติบอดี้ นี้เองจึงทำให้วิธีการนี้ถูกเรียกว่า Sandwich ELISA) หลังจากนั้นจึงเติมแอนติบอดี้ตัวที่สามที่เชื่อมกับเอนไซม์ เพื่อให้เอนไซม์เข้ามาย่อยซับเสตรท (hydrogen peroxide) จนเกิดสี การใช้แอนติบอดี้สามตัวในการทำปฏิกิริยาจะเรียกวิธีการนี้ว่า Triple Antibody Sandwich ELISA (TAS ELISA) หรือ Indirect Sandwich ELISA โดยปริมาณ substrate ที่ถูกย่อยจะเท่ากับ ปริมาณ antigen ในสิ่งตัวอย่าง ยิ่งมีปริมาณแอนติเจนมากสีที่เปลี่ยนแปลงก็จะมีความเข้มมากขึ้น
วิธีการ Colorimetric ELISA นี้ ถึงแม้จะแสดงให้เห็นถึงการเปลี่ยนสี แต่ถ้าปริมาณของ p24 มีจำนวนน้อย ก็อาจไม่เห็นการเปลี่ยนแปลงของสี
ข้อเสียของวิธีการตรวจแบบนี้คือ ความไวยังน้อย (ตรวจไม่ค่อยเจอ) สีที่เปลี่ยนแปลงจะไม่สามารถสังเกตเห็นได้ถ้าปริมาณแอนติเจน (p24) ที่อยู่ในตัวอย่างมีน้อย และไม่เหมาะที่จะใช้เป็นวิธีคัดกรอง (screening test) เบื้องต้น
นอกจากข้อเสียที่กล่าวมาแล้วยังมีข้อจำกัดบางประการเกี่ยวกับวิธีการตรวจแบบ ELISA คือ ผลที่ได้นั้นจะมีความถูกต้องแม่นยำสูงมากน้อยแค่ไหนนั้นขึ้นอยู่กับประสบการณ์ของผู้ทำการทดสอบแล้วยังขึ้นกับปัจจัยอื่นอีกเช่น เครื่องมือที่ใช้ในการทดสอบมีวัสดุสิ้นเปลืองที่เกิดขึ้นและต้องกำจัดทิ้งแบบปลอดเชื้อ ต้องมีการเตรียมน้ำยาก่อนการใช้งาน ต้องมีกระแสไฟฟ้าที่คงที่ ต้องใช้ตู้เย็นในการเก็บรักษาน้ำยา และต้องใช้น้ำกลั่นที่บริสุทธิ์ในการทำการทดสอบ การทดสอบที่ต้องใช้เวลาในการทำการทดสอบประมาณ 60 – 90 นาที และต้องรอจำนวนการทดสอบให้มีจำนวนระดับหนึ่งให้เหมาะสมกับการเริ่มต้นทำการทดสอบนั้นคือการทดสอบแบบ ELISA จะเหมาะกับการตรวจที่มีตัวอย่างรอการตรวจเป็นจำนวนมากเช่นโรงพยาบาลขนาดใหญ่ของรัฐที่มีอุปกรณ์ บุคลากรและตัวอย่างการทดสอบที่มีจำนวนมากพอ
ส่วนสถานที่ตรวจที่ต้องการความเร่งด่วนในผลการตรวจหรือมีการขอตรวจมาเป็นระยะ หรือไม่สามารถที่จะใช้เครื่องมือระดับ ELISA ได้ ก็จะใช้ชุดตรวจคัดกรองขั้นต้นซึ่ง ในการพัฒนาชุดทดสอบในปัจจุบันแทบจะไม่มีความแตกต่างทั้งด้าน sensitivity และ specificity โดยปกติแล้วชุดตรวจแบบคัดกรองขั้นต้น CICA (color immuno chromatographic assay) จะให้ sensitivity ที่ดีกว่า ส่วนวิธี ELISA จะให้ด้าน specificity ที่ดีกว่า ดังนั้นการจะเลือกใช้วิธี Elisa หริอวิธี Rapid immuno screening test pattern ในการตรวจเพื่อป้องกันการผิดพลาดในรูปแบบที่เหมือนกัน
ศาสตราจารย์มอลลี่ สตีเฟน จากคณะวัสดุศาสตร์และวิศวกรรมชีวภาพ ทำงานวิจัยนี้ได้อาศัยหลักการ Triple Antibody Sandwich ELISA (TAS ELISA) เช่นเดียวกันแต่พัฒนาในส่วนของการทำให้เกิดสีจากการทำปฏิกิริยาระหว่างเอนไซม์กับซับสเตรทโดยอาศัยอนุภาคทองนาโนเป็นตัวกำหนดสี นักวิจัยเรียกวิธีใหม่นี้ว่าPlasmonic ELISA
คุณสมบัติของอนุภาคทองนาโนคือ "เมื่อขนาดของอนุภาคเปลี่ยนไป จะทำให้สีของตัวอนุภาคเปลี่ยนไปด้วย" ศาสตราจารย์มอลลี่ สตีเฟน จึงนำคุณสมบัติข้อนี้มาใช้ในงานวิจัย
หลักการการทำงานของ วิธี Plasmonic ELISA คือ หลังจากใส่แอนติบอดี้ตัวที่สามที่เชื่อมอยู่กับเอนไซม์เข้าไปแล้ว เอนไซม์นั้นจะทำงานสัมพันธ์กับอนุภาคทองนาโน โดยจะเปลี่ยนเป็นสีฟ้า หรือแดงขึ้นอยู่กับการมีอยู่ของไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ที่ถูกใส่ลงไปเพื่อเป็นซับสเตรท ถ้าในตัวอย่างไม่มีแอนติเจน p24 ไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ก็จะไม่จับกับเอนไซม์ที่เชื่อมกับแอนติบอดี้ตัวที่สาม ก็จะมีไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์อิสระที่คอยให้อิเล็กตรอนแก่อนุภาคทองนาโน อนุภาคทองนาโนก็จะไม่เกิดการจับตัวเป็นก้อน จึงเห็นสารละลายเป็นสีแดงแต่ถ้าในสารละลายตัวอย่างมีแอนติเจน p24 อยู่เอนไซม์จะไปใช้ไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ที่เติมลงไป ทำให้อนุภาคทองนาโนเกิดการจับตัวเป็นก้อน สารละลายจึงเปลี่ยนเป็นสีน้ำเงิน
ด้วยการใช้อนุภาคทองนาโนเพื่อให้เห็นการเปลี่ยนแปลงสีของสารละลายนี้เอง ทำให้เทคนี้ถูกพัฒนาขึ้นมานี้มีความไวและแม่นยำเพิ่มมากขึ้น สามารถนำไปใช้เป็นใช้เป็นชุดตรวจขั้นต้นเพื่อการคัดกรองผู้ป่วยที่ติดเชื้อ HIV ได้ โดยไม่ต้องใช้เครื่องมือที่ยุ่งยาก ไม่ต้องอาศัยเทคนิคและประสบการณ์ของผู้ทำการทดสอบ เนื่องจากการแปลผลของเทคนิคนี้อาศัยเพียงแค่ตาเปล่าในการสังเกตสีที่เปลี่ยนไปของสารละลายตัวอย่างเท่านั้น
อีกทั้งวิธีการนี้สามารถลดระยะ window period ลงมาอยู่ที่ 30 - 45 วันหลังจากการติดเชื้อ ทำให้ผู้ป่วยมีโอกาสได้รับการรักษาอย่างทันท่วงที สาเหตุที่สามารถลดระยะของ window period ได้เนื่องจากวิธีการตรวจแบบPlasmonic ELISA ในงานวิจัยนี้ ใช้อนุภาคนาโนของทองเป็นตัวกำหนดสีจากการเกิดปฏิกิริยาการทดสอบตัวอย่าง แทำให้เพิ่มประสิทธิภาพในการตรวจจับและมีความไว (sensitivity)ในการตรวจจับเพิ่มขึ้นอย่างมาก โดยความไว(sensitivity) ของวิธีการนี้อยู่ที่ 1.0 x 10-18 g/ml หรือในตัวอย่างเลือด 1 มิลลิลิตร ถ้ามีแอนติเจน p24 อยู่ 1.0 x 10-18 กรัม จะสามารถตรวจพบว่าผู้ป่วยมีการติดเชื้อ HIV ได้ ซึ่งจากเดิมจะตรวจพบเมื่อมีแอนติเจนอยู่อย่างน้อย 1.0 x 10-9 กรัม ต่อเลือด 1 มิลลิลิตร
และเนื่องจากวิธีการวิเคราะห์นั้นไม่ยุ่งยากซับซ้อน จึงสามารถลดต้นทุนที่ใช้ในการตรวจวัด ดังนั้นการใช้วิธีการPlasmonic ELISA นี้จะทำให้ราคาถูกกว่าเกือบ 10 เท่าของวิธีการตรวจแบบเดิม อีกทั้งวิธีการนี้ยังสามารถนำไปตรวจหาโรคอื่นๆ ได้อีกหลายโรคไม่จำกัดแค่การตรวจหาเชื้อ HIV เท่านั้น ยกตัวอย่างเช่น โรคมะเร็งต่อมลูกหมาก ใช้หลักการเดียวกันการตรวจหา HIV biomarker แต่เปลี่ยนเป็น biomarker ของโรคมะเร็งต่อมลูกหมากแทน
ปัจจุบันชุดตรวจกรองขั้นต้นที่ใช้หลักการนี้ได้เริ่มมีการใช้ในต่างประเทศที่เจริญแล้ว สำหรับบ้านเราต้องรอการตรวจสอบรับรองจากทาง อย. ก่อนจึงจะสามารถนำมาใช้ได้ การที่มีความไวในการตรวจจับสูงนี่เอง ทำให้สามารถตรวจพบผู้ป่วยในระยะแรกก่อนที่จะมีการแพร่กระจายเชื้อภายในร่างกายเป็นจำนวนมากได้ ซึ่งหมายถึงโอกาสที่จะสามารถรักษาหรือควบคุมอาการจะมีโอกาสเพิ่มขึ้นเป็นอย่างมาก
ก
